تأكل. تشودينوف ، ف. بلاتونوف ، أ. الكسندروفا ، س. إيلانسكي
لقد ثبت مؤخرًا أن الفطر غير الفطري Ilyonectria crassa قادر على إصابة درنات البطاطس. هذا العمل هو الأول من نوعه لتحليل الخصائص البيولوجية ومقاومة بعض مبيدات الفطريات من سلالة I. crassa المعزولة من البطاطس. تزامنت تسلسلات المناطق الخاصة بالأنواع من سلالة "البطاطس" مع تلك التي تم الحصول عليها سابقًا للفطريات المعزولة من جذور النرجس البري والجينسنغ والحور الرجراج والزان وبصلات الزنبق وأوراق التوليب. على ما يبدو ، يمكن أن تكون العديد من النباتات البرية ونباتات الحدائق محميات لـ I. crassa. أصابت السلالة التي تم فحصها شرائح الطماطم والبطاطس ولكنها لم تصيب فاكهة الطماطم بأكملها ودرنات البطاطس السليمة. هذا يدل على أن I. crassa هو طفيلي جرح. أظهر تقييم مقاومة فلوديوكسونيل وديفينوكونازول وأزوكسيستروبين على وسط غذائي فعالية عالية لهذه الأدوية.
كان مؤشر EC50 (تركيز مبيد الفطريات ، الذي يبطئ بمقدار ضعفي معدل النمو الشعاعي للمستعمرة بالنسبة للتحكم في مبيدات الفطريات) يساوي 2 ؛ 0.4 و 7.4 ملغم / لتر على التوالي. يجب أن تؤخذ إمكانية تطور المرض الناجم عن I.crassa في الاعتبار عند التقييم المرضي للنباتات لدرنات البطاطس وتطوير تدابير حماية النبات.
يؤدي تطور الكائنات الدقيقة المسببة للأمراض النباتية إلى خسائر كبيرة في جميع مراحل زراعة البطاطس وتخزينها. عند التخطيط للتدابير الوقائية ، كقاعدة عامة ، يتم أخذ مسببات الأمراض المعروفة في الاعتبار ، مثل الأنواع من أجناس Alternaria و Fusarium و Phoma و Helminthosporium و Colletotrichum و Phytophthora وما إلى ذلك. ومع ذلك ، في السنوات الأخيرة ، ظهرت المزيد والمزيد من التقارير حول ظهور كائنات دقيقة جديدة ممرضة للنبات على البطاطس. تتم دراسة بيولوجيتهم بشكل سيئ ، وفعالية مبيدات الفطريات المستخدمة في البطاطس بالنسبة لهم غير معروفة ، ولم يتم تطوير طرق التشخيص. مع التطور الشامل ، فهي قادرة على إحداث ضرر كبير لمحصول البطاطس. أحد هذه الكائنات الحية الدقيقة هو الفطريات غير الفطرية Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous ، التي اكتشفها المؤلفون لأول مرة على درنات البطاطس (Chudinova et al. ، 2019).
يقدم هذا العمل نتائج تحليل سلالة I. crassa المعزولة من درنات البطاطس. تمت دراسة مورفولوجيا المستعمرات والتراكيب الفطرية لـ I.crassa ، وتسلسل النيوكليوتيدات لمناطق الحمض النووي الخاصة بالأنواع ، وفوعة البطاطس والطماطم ، ومقاومة بعض مبيدات الفطريات الشائعة.
المواد والأساليب
استخدمنا سلالة I. crassa 18KSuPT2 المعزولة في 2018 من درنة البطاطس المصابة المزروعة في منطقة كوستروما. تأثرت الدرنة بنوع من العفن الجاف مع تجويف مغطى بمايسيليوم بني فاتح. باستخدام إبرة تشريح معقمة ، تم نقل الفطريات الفطرية إلى طبق بتري مع وسط أجار (نبتة بيرة 10٪ ، أجار 1.5٪ ، بنسلين 1000 وحدة / مل). تم تحضين الأطباق في الظلام عند 24 درجة مئوية.
تم استخدام مجهر ضوئي Leica DM2500 مع كاميرا رقمية ICC50 HD ومجهر ثنائي العينين Leica M80 بكاميرا رقمية IC80HD (Leica Microsystems ، ألمانيا) لتصوير وتقييم حجم وتشكل الجراثيم والأعضاء البوغية.
لعزل الحمض النووي ، نمت الفطريات الفطرية في وسط البازلاء السائل ، ثم تم تجميدها في نيتروجين سائل ، وتجانسها ، واحتضانها في محلول CTAB ، وتنقيتها بالكلوروفورم ، وغسلها مرتين باستخدام 2٪ كحول.
تم وصف طريقة استخراج الحمض النووي بالتفصيل في مقالة بقلم كوتوزوفا وآخرون. (2017).
لتحديد الأنواع بالطرق الجزيئية والمقارنة مع سلالات I. crassa المعروفة الأخرى ، تم إجراء PCR باستخدام بادئات سمحت بتضخيم مناطق الحمض النووي الخاصة بالأنواع: ITS1-5,8،2S-ITS5 (بادئات ITS4 / ITS1990 ، White et al. ، 2) ، مناطق الجينات ب - التوبولين (Bt2a / Bt1995b، Glass، Donaldson، 1) وعامل استطالة الترجمة 1α (tef1α) (البادئات EF728-1F / EF986-1999R، Carbone and Kohn، 3.1). تم استخراج الأمبليكونات بالطول المطلوب من الجل باستخدام مجموعة Evrogen CleanUp تم تسلسل المناطق المضخمة باستخدام BigDye® Terminator v3730 Cycle Sequence Kit (Applied Biosystems ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) على جهاز التسلسل الآلي Applied Biosystems 6 xl (Applied Biosystems ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استخدام تسلسل النوكليوتيدات الذي تم الحصول عليه للبحث عن تطابق في قاعدة بيانات GenBank للمركز الوطني الأمريكي لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI). تم إجراء التحليل الوراثي باستخدام برنامج MEGA 2013 (Tamura et al. ، XNUMX).
تم إجراء تقدير الفوعة على فواكه خضراء كاملة من الطماطم كبيرة الثمار (صنف دوبرافا) ودرنات البطاطس (صنف غالا). بالإضافة إلى ذلك ، لمحاكاة الأضرار التي لحقت بالفواكه والدرنات التالفة ، استخدمنا شرائح من نفس الفاكهة والدرنات. تم وضع شرائح من الدرنات في غرف رطبة ، والتي كانت عبارة عن أطباق بتري مع ورق ترشيح مبلل في الأسفل. تم وضع شريحة على الورقة ، والتي بدورها تم وضع شرائح من الدرنات أو الفاكهة. تم وضع الدرنات والفواكه الكاملة أيضًا في حاويات بها ورق ترشيح مبلل في الأسفل. في وسط الشريحة (أو على السطح السليم للدرنات أو الفاكهة) ، تم وضع قطعة أجار (5 × 5 مم) مع خيوط فطرية بعد 5 أيام من النمو على أجار نبتة.
تم إجراء تقييم مقاومة السلالات الفطرية لمبيدات الفطريات في ظروف معملية على وسط مغذي أجار. درسنا القابلية لمبيدات الفطريات Maxim ، KS (المكون النشط fludioxonil ، 25 جم / لتر) ، Quadris ، KS (azoxystrobin 250 g / l) ، Scor ، EC (ديفينوكونازول 250 جم / لتر) (كتالوج الدولة ... ، 2020). تم التقييم في أطباق بتري على وسط نبتة أجار مع إضافة الأدوية المدروسة بتركيزات المادة الفعالة 0.1 ؛ واحد. 1 جزء في المليون (ملغم / لتر) (للفلوديوكسونيل والديفينوكونازول) ، 10 ؛ عشرة؛ 1 جزء في المليون (لأزوكسيستروبين) وفي وسط بدون مبيد فطري (تحكم). يضاف مبيد الفطريات إلى الوسط المذاب ويبرد إلى وسط 10 درجة مئوية ، وبعد ذلك يُسكب الوسط في أطباق بتري. تم وضع كتلة أجار مع الفطريات الفطرية في وسط طبق بتري وتم تربيتها عند درجة حرارة 100 درجة مئوية في الظلام. بعد 60 أيام من الحضانة ، تم قياس أقطار المستعمرات في اتجاهين متعامدين بشكل متبادل ؛ تم حساب متوسط نتائج القياس لكل مستعمرة. وقد أجريت التجارب في ثلاث نسخ. بناءً على نتائج التحليلات ، تم حساب التركيز الفعال 24 ، بما يعادل تركيز مبيد الفطريات ، مما أدى إلى خفض معدل النمو الشعاعي للمستعمرة إلى النصف مقارنة بمكافحة مبيدات الفطريات.
نتائج ومناقشة
على أطباق بتري مع أجار نبتة ، شكل الفطر مستعمرات مع الفطريات البيضاء النضرة. تحول الوسط الموجود تحت الميسيليوم إلى بني محمر. عندما يجف الوسط ، تشكل الفطريات جراثيم من نوعين على حوامل مخروطية مفردة ومتجمعة في أبواغ صغيرة. Macroconidia ممدود ، أسطواني ، مع واحد إلى ثلاثة حواجز ، متوسط الطول 27.2 ميكرومتر مع مجموعة من القيم من 23.2 إلى 32.2 ميكرومتر ، العرض - حتى 4.9 ميكرومتر (الشكل 1). يبلغ متوسط طول الميكروكونيديا 14.3 ميكرومتر مع نطاق قيم من 10.3 إلى 18.1 ميكرومتر ، والعرض يصل إلى 4.0 ميكرومتر. تتلاءم جميع الصفات الكلية والميكرومورفولوجية مع مجموعة تنوع الأنواع Ilyonectria crassa (Cabral et al. ، 2012).
تزامنت تسلسلات مناطق الحمض النووي الخاصة بالأنواع (ITS ، b-tubulin ، TEF 1α) تمامًا مع تسلسل سلالات I. crassa التي درسناها سابقًا (Chudinova et al. ، 2019 ، الجدول 1). لدراسة انتشار I.crassa في مناطق أخرى ولتحليل طيف الثقافات المصابة ، تم تحليل تسلسل الحمض النووي المتماثل في قاعدة بيانات GenBank (الجدول 1). كان التداخل من 86 إلى 100٪. كانت تسلسلات مناطق الحمض النووي الثلاثة لسلالة "البطاطس" I. crassa مطابقة لتسلسل السلالات المعزولة من بصلة الزنبق وجذور النرجس في هولندا ومن جذر الجينسنغ في كندا. فشلنا في العثور على سلالات أخرى من النوع I. crassa مع ثلاثة متواليات مماثلة تم تحليلها في قواعد البيانات المفتوحة. ومع ذلك ، أظهر تحليل تسلسل ITS و b-tubulin المودعة وجود I. crassa على أوراق التوليب في المملكة المتحدة. تم تحديد الفطريات ذات تسلسل ITS مماثل في تحليل الفطريات الفطرية لجذور الحور الرجراج في كندا وجذور الزان في إيطاليا ودرنات البطاطس في المملكة العربية السعودية (الجدول 1). تظهر نتائج هذه الدراسة أن I.crassa لها توزيع عالمي وقادر على إصابة أنواع النباتات المختلفة.
عند تحديد القدرة المرضية على شرائح الطماطم والبطاطس في اليوم الخامس ، وصل قطر الآفة إلى 5 سم ، ولم تصيب السلالة التي تم فحصها ثمار الطماطم الكاملة ودرنات البطاطس السليمة. ومع ذلك ، تأثرت الكؤوس على الطماطم. لاستبعاد احتمال التلوث ، تم عزل عزل فطري من الفطريات المطورة على شريحة درنة البطاطس في مزرعة نقية. كانت مطابقة تمامًا لسلالة الوالدين. على ما يبدو ، I. crassa هو طفيلي جرح.
تقلل المعالجة المسبقة لزراعة درنات البذور بمبيدات الفطريات من تطور الأمراض على النباتات خلال موسم النمو. لاختيار مبيدات الفطريات الفعالة ، من المهم تقييم أي منها فعال ضد I. сrassa. درس العمل المواد الفعالة واسعة الانتشار لمبيدات الفطريات - فلوديوكسونيل ، أزوكسيستروبين ، ديفينوكونازول. يتم تضمين فلوديوكسونيل في العديد من الخلائط المستخدمة في تلبيس البذور ودرنات البذور قبل الزراعة. يستخدم Fludioxonil (Maxim) أيضًا لعلاج درنات البذور قبل التخزين. يتم أيضًا تضمين Difenoconazole و azoxystrobin في عدد من المستحضرات المستخدمة لمعالجة مواد البذور ، وكذلك في المستحضرات المعدة لمعالجة النباتات النباتية (كتالوج الدولة ... ، 2020).
تمت دراسة معدل نمو I. crassa على الوسائط (الشكل 2) بتركيزات مختلفة من المواد الفعالة: فلوديوكسونيل (EC50 = 0.4 جزء في المليون) ، أزوكسيستروبين (EC50 = 4 جزء في المليون) ، وديفينوكونازول (EC50 = 7.4 جزء في المليون) (الجدول 2). يمكن اعتبار هذه المستحضرات فعالة للغاية ضد I.crassa ، حيث أن EC50 الخاص بها أقل بكثير من التركيز الموصى به من المستحضر في السائل العامل المستخدم في معالجة الدرنات. وفقًا لكتالوج الولاية ... (2020) ، يتراوح تركيز فلوديوكسونيل في السائل لمعالجة درنات البطاطس من 500 إلى 1000 جزء في المليون ، والآزوكسيستروبين (في السائل لمعالجة قاع الأخدود) - 3750-9375 جزء في المليون ، ديفينوكونازول (في السائل لمعالجة النباتات النباتية) - 187.5 - 625 جزء في المليون.
الجدول 1. تشابه تسلسلات السلالة الخاصة بالأنواع 18KSuPT2 وسلالات Ilyonectria crassa المتاحة في قاعدة بيانات Genbank
التواء | النبات المضيف ، موقع الإخراج | أرقام التسلسل المودعة في GenBank ، النسبة المئوية لأوجه التشابه | رابط | ||
انها | بيتا توبولين | TEF 1α | |||
17KSPT1 و 18 KSuPT2 | درنة البطاطا بمنطقة كوستروما | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova وآخرون ، 2019 ، هذا العمل |
سي بي اس 158/31 | جذور النرجس ، هولندا | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | كابرال وآخرون ، 2012 |
سي بي اس 139/30 | ليلي بولب ، هولندا | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | جذر الجينسنغ ، كندا | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | نبات التوليب ، المملكة المتحدة | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | دينتون ، دينتون ، 2014 |
MT294410 | جذور أسبن ، كندا | MT294410 100 | ND | ND | رامسفيلد وآخرون ، 2020 |
ER1937 | الزان ، إيطاليا | KR019363 99.65 | ND | ND | تيزاني ، هيجي ، موتا. التقديم المباشر |
KAUF19 | درنة البطاطا ، المملكة العربية السعودية | HE649390 98.3 | ND | ND | القشقري ، الغرباوي ، 2013 |
ND = غير مودع
الجدول 2. مقاومة الإليونيكتريا كراسا لمبيدات الفطريات
(المادة الفعالة) | EC50 ، جزء في المليون | ||||
3 اليوم | 5 اليوم | 7 اليوم | |||
السيطرة | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
كوادريس ، كانساس (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
مكسيم ، كانساس (فلوديوكسونيل) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
سكور ، EC (ديفينوكونازول) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
في عملنا ، تم عزل سلالات I. crassa من درنات البطاطس في منطقتي Kostroma و Moscow (Chudinova et al. ، 2019). تم الكشف عن نسبة عالية من السلالات الفطرية مع تسلسل ITS مطابق لـ I.crassa في تحليل الفطريات الفطرية لدرنات البطاطس في المملكة العربية السعودية (Gashgari and Gherbawy ، 2013). على ما يبدو ، أنا كراسا ليست نادرة على البطاطس كما قد يبدو. أظهرت تجاربنا أن الفطر يمكن أن يصيب ثمار الطماطم التالفة. من المعروف من الأدبيات أن I.crassa قادر على التطور في التربة بشكل رمي (Moll et al. ، 2016) ، بالإضافة إلى التأثير على مجموعة متنوعة من النباتات ، حتى تلك البعيدة تصنيفيًا مثل أزهار النرجس البري ، الزنابق ، الجينسنغ ، الحور الرجراج ، والزان (الجدول 1). واحد). على ما يبدو ، يمكن أن تكون العديد من النباتات البرية ونباتات الحدائق محميات لـ I. crassa. يوضح ما سبق أنه عند تطوير تدابير الحماية ، من الضروري مراعاة إمكانية التأثير على درنات البطاطس بهذه الفطريات. أظهرت المستحضرات المنتشرة لعلاج درنات البطاطس المحتوية على فلوديوكسونيل وأزوكسيستروبين وديفينوكونازول فاعلية عالية في مبيدات الفطريات ضد بكتريا الكراسا.
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الروسية للأبحاث الأساسية (المنحة رقم 20-016-00139).
تم نشر المقال في مجلة "Plant Protection Bulletin" ، 2020 ، 103 (3).